随着农药的普及，近年来农药中毒的事件逐年递增[1]。现阶段常见的农药包括矿物源农药、生物源农药和化学合成农药(敌敌畏、百草枯等)[2]。敌敌畏是一种较为常见的有机磷农药，这类农药可抑制乙酰胆碱酯酶，造成延迟周围神经病变[3]。百草枯中毒后会直接作用于中毒者的器官，造成肺、心、肝、肾功能衰竭导致患者死亡[4]。乌司他丁(utinastatin， UTI)是抗炎药物之一，其作用机制是通过下调促炎因子和上调抗炎因子，同时调控或阻断机体炎症反应过程实现对炎症的抑制[5]。UTI是一种高效的酶抑制剂，可抑制多种蛋白酶，具有防御组织破坏的作用。目前已有研究证实UTI可减轻急性百草枯和敌敌畏中毒，但对于UTI对农药中毒大鼠脑组织保护作用机制的报道较少。本文旨在研究UTI对农药中毒大鼠脑组织保护作用，以期了解其作用机制，从而为农药中毒提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：SPF级3周龄SD大鼠60只，体重200～220 g(广东医学院实验动物中心，实验动物许可证号：粤监证字 2004A029号)。饲养于本院动物中心实验室，分12笼饲养，每笼5只。饲养温度20～25℃，相对湿度50%～65%。该实验经动物伦理委员会批准同意。

1.1.2药物与试剂：农药(草铵膦)购自四季丰园有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde ,MDA)试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)试剂盒购自上海索桥生物有限公司；NMDA受体试剂盒购自江莱生物；超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司；PTEN诱导激酶1(PTEN-inducible kinase 1, Pink1)抗体购自艾美捷科技有限公司；过氧化物还原酶6(peroxide reductase 6, Prdx6)抗体购自上海龙田生物技术有限公司；中性福尔马林、乙醇、二甲苯均购自天津科密欧有限公司。

1.1.3实验仪器：BS-124s 型电子天平(北京赛多斯仪器系统有限公司)；TDL-5 型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；光学显微镜(东莞市同创仪器有限公司)；低温离心机(湖南恒诺离心机有限公司)；蛋白电泳及转膜仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(以色列DNR公司)；BS-124s 型电子天平(北京赛多斯仪器系统有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组及建立模型：60只SD大鼠适应性喂养 1 周后，随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组，每组15只。对照组大鼠腹腔注射生理盐水2 ml，其余3组大鼠均给予腹腔注射农药2 ml造模，造模后立即观察大鼠一般状态及症状并记录。

1.2.2药物干预：建立模型后2 h，低剂量组腹腔内注射UTI 75 kU/kg，高剂量组腹腔内注射UTI 150 kU/kg，对照组和模型组分别腹腔内注射和高剂量组等量的生理盐水。

1.3观察指标及方法

1.3.1大鼠一般情况观察：建立模型并使用药物干预完成后立即观察大鼠一般状态及症状并记录。当大鼠出现全身颤动、口腔分泌物增多、步态不稳中的任意一项即判定为中毒。大鼠肌颤强度分为4级，具体分级方式参考戴旭锋等[6]研究。

1.3.2血清中氧化应激物质及炎性因子检测：建立模型并使用药物干预完成后24 h，使用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，腹主动脉取血分离血清，保存在-20℃条件下待测，按照试剂盒说明书检测MDA、GSH-Px、TNF-α、IL-6含量。

1.3.3脑组织及全血AChE活力及NMDA受体活性检测：建立模型并使用药物干预完成后24 h，处死大鼠，取大鼠脑组织使用冰生理盐水冲洗，按照1∶9制成10%的组织匀浆，使用恒温离心机，在4℃、3500 r/min离心的条件下离心10 min，去上清液，在-20℃冻存待测，测定大鼠全血和脑组织的AChE活力及NMDA受体的活性，使用Scatchard作图并求出NMDA受体的最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。

blot 检测蛋白表达水平：取各组大鼠海马区脑组织并用剪刀剪取小块，使用胰蛋白酶处理，提取组织总蛋白，使用半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗净，以β-actin为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.4统计学方法 本研究采用统计学软件SPSS 22.0分析数据，GraphPda Prism 5软件作图。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析。α=0.05为检验水准。

2结果