在临床和法医毒理学领域，常需对血液、尿液、胃内容物和内脏器官等生物检材中的毒物进行筛查和定量，以寻找疾病或死亡的原因[1-3]。常见的毒物主要包括农药、杀鼠剂、金属毒物、挥发性毒物、临床药物、毒品、植物毒素、动物毒素、无机毒物9大类[4]。近年随着农业的发展，农药的种类日益增多，使用范围不断扩大。常见的农药主要包括有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、除草剂及其它水溶性农药[4]。农药的使用在提高农业生产效益的同时，也使各类有机污染物在环境和生物体内积累，对生态环境和人类健康构成了严重威胁。大量研究表明，农药暴露与某些慢性疾病的发生率升高之间存在联系，包括癌症、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、糖尿病、心血管疾病、慢性肾脏病及不育症等[5]。慢性疾病的常见特征是细胞稳态的紊乱，它往往可以通过农药对离子通道或酶受体等的扰动而诱发[5]。此外，由于意外、自杀或故意犯罪而导致的急性农药中毒案例也时见报道[6]。目前对农药残留的高通量检验研究多集中在食品和环境样本，研究者们建立了高通量检测蔬菜、水果、茶叶、月柿、中药材等样本中农药残留的方法[7-11]。本文致力于建立人体血液中农药的高通量检验方法，为临床和法医毒理学中农药的快速检验提供技术支持。

检测血液样本中农药的常用方法有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，配置紫外(UV)或二极管阵列检测器(DAD)的高效液相色谱法(HPLC)以及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[12-13]。其中串联质谱技术因其高灵敏度、高专属性和高通量的优势，得到了广泛应用[14]。由于气相色谱在亲水性、热不稳定性和非挥发性农药中的适用性受限，更多检测以液相色谱-串联质谱技术为主[15]。本研究结合实际中毒案例，选取了常见的115种农药，包括59种有机磷类农药、19种拟除虫菊酯类农药、17种氨基甲酸酯类农药、17种除草剂，以及昆虫生长调节剂类杀虫剂噻嗪酮、人工合成的沙蚕毒素的类似物杀虫单、低毒性杀菌剂三唑酮(详见表1)。结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术进行分析研究，通过优化分析条件和提取净化方式，建立了同时测定血液中115种农药的方法。该方法简单高效，实现了一针进样同时对百种农药进行分析的目的，对临床和法医毒物检验工作具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

LC-30A HPLC仪器(日本Shimadzu公司)，配备两个LC-30A泵，SIL-30A自动进样器，CTO-30A恒温柱室和DGU-30A脱气机；具有Turbo VTM离子源的5500 QTRAP三重四极杆质谱系统(美国Sciex公司)；Milli-Q去离子水系统(法国Millipore公司)；DHC-台式高速离心机(澳洲Kewlab公司)；Vortex-Genie2可调速涡旋混合器(美国SI公司)；移液器和2 mL离心管(德国Eppendorf公司)。

115种农药标准品(纯度> 95%，德国)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸铵(HPLC级，美国Fisher Scientific)；空白血由首都医科大学附属复兴医院提供。

1.2 标准溶液的制备

用甲醇将质量浓度为10.0 μg/mL的混合标准品溶液稀释至2.0 μg/mL，制得标准储备溶液，将其在-20 ℃密封避光储存。使用时用甲醇将标准储备液稀释成1.0 μg/mL的标准中间溶液，再逐级稀释为200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的标准工作液，4 ℃下密封避光保存。精确配制1.0 mol/L的甲酸铵标准储备液，4 ℃下密封避光保存。

1.3 样品的前处理

准确移取200 μL样品于2 mL离心管中，加入1 000 μL甲醇作沉淀剂，涡旋振荡2 min，以12 000 r/min离心10 min，取上清液于配套液质进样瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色谱条件

Kinetex Biphenyl色谱柱(100 mm × 3.0 mm，2.6 μm)，柱温40 ℃，进样量2 μL。流动相：A相为含5 mmol/L甲酸铵的水溶液；B相为含5 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；流速0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.1 min，3%～40% B；1.1～2.0 min，40%～60% B；2.0～7.0 min，60%～80% B；7.0～10.0 min，80%～83% B；10.0～10.1 min，83%～95% B；10.1～13.0 min，95%～98% B；13.0～15.5 min，98% B；15.5～15.6 min，98%～3% B；15.6～19.0 min，3% B。

1.5 质谱条件

离子源和扫描方式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)和电喷雾电离负离子模式(ESI-)同时切换扫描；检测方式：Scheduled MRM；喷雾电压IS：5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；雾化气(GS1)：379 225 Pa，离子源温度(TEM)：550 ℃；气帘气(CUR)：241 325 Pa；辅助气(GS2)：341 750 Pa；碰撞气(CAD)：48 265 Pa；化合物的射入电压(EP)和碰撞室射出电压(CXP)，在正离子模式时为10 V和17 V，负离子模式时为-10 V和-17 V。经过优化的所有分析物的其他参数，包括定量与定性离子对、去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)，见表1。仪器控制、数据采集和处理使用Analyst 1.6.3和SCIEX OS 1.5软件进行。